蛋白质含量测定方法解析(3)

　　三、Folin—酚试剂法(Lowry法)

　　(一)实验原理

　　这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难(现在已可以订购)，近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。‚Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色(钼兰和钨兰的混合物)。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。

　　Folin—酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰Lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素(0.5%)，硫酸纳(1%)，硝酸纳(1%)，三氯乙酸(0.5%)，乙醇(5%)，乙醚(5%)，丙酮(0.5%)等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1~2倍。

　　进行测定时，加F olin—酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定，但上述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当Folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂 被破坏之前，还原反应即能发生。

　　此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。

　　此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20~250mg。

　　(二)试剂与器材

　　1.试剂

　　(1)试剂甲：

　　(A) 10克 Na2CO3，2克 NaOH和0.25克酒石酸钾钠 (KNaC4H4O6•4H2O)。溶解于500毫升蒸馏水中。

　　(B) 0.5克硫酸铜(CuSO4•5H2O)溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份(A)与1份(B)混合，即为试剂甲。

　　(2)试剂乙：

　　在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠(Na2WO4•2H2O),25克钼酸钠(Na2MoO4•2H2O)及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克 硫 酸 锂(Li2SO4)，50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色(如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤)。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1N左右。

　　(3)标准蛋白质溶液:

　　精确称取结晶牛血清清蛋白或 g—球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250 mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9 % NaCl溶液。

　　2. 器材

　　(1)可见光分光光度计

　　(2)旋涡混合器

　　(3)秒表

　　(4)试管16支

　　(三)操作方法

　　1. 标准曲线的测定：取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液(浓度为250mg/ml)。用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温(20～25℃)放置10分钟。再逐管加入0.5毫升试剂乙(Folin—酚试剂)，同样立即混匀。这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。

　　注意：因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第1支试管加入5毫升试剂甲后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入5毫升试剂甲，2分钟后加第3支试管，余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟，则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙，1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙，2分钟后加第3支试管，余此类推。待最后一支试管加完试剂后，再放置30分钟，然后开始测定光吸收。每分钟测一个样品。

　　进行多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格。表中是每个试管要加入的量(毫升)，并按由左至右，由上至下的顺序，逐管加入。最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量(微克)和测得的吸光度值。

　　Folin—酚试剂法实验表格：

　　管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

　　(250mg/ml)

　　未知蛋白质 0.2 0.4 0.6

　　(约250mg/ml)

　　蒸馏水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4

　　试剂甲 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0

　　试剂乙 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5