蛋白质含量测定方法解析(2)

　　Tris缓冲液;

　　甘氨酸;

　　各种硫醇 耗费时间长;操作要严格计时;

　　颜色深浅随不同蛋白质变化 考马斯亮蓝法(Bradford法) 灵敏度最高

　　1～5mg 快速

　　5～15分钟 考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其lmax由465nm变为595nm 强碱性缓冲液;

　　TritonX-100;

　　SDS 最好的方法;

　　干扰物质少;

　　颜色稳定;

　　颜色深浅随不同蛋白质变化

　　二、双缩脲法(Biuret法)

　　(一)实验原理

　　双缩脲(NH3CONHCONH3)是两 个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。

　　H2O

　　O=C C=O

　　HN NH

　　R-CH CH-R

　　O=C Cu C=O

　　HN NH

　　R-CH CH-R

　　H2O

　　紫色络合物

　　紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。

　　此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

　　(二)试剂与器材

　　1. 试剂：

　　(1)标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白(BSA)或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0.05N NaOH配制。

　　(2)双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜(CuSO4•5H2O)和6.0克酒石酸钾钠(KNaC4H4O6•4H2O)，用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中(或内壁涂以石蜡的瓶中)。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。

　　2. 器材：

　　可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。

　　(三)操作方法

　　1. 标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温(20~25℃)下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。

　　2、样品的测定：取2~3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。