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蛋白质含量测定方法解析(2)

[作者:ctktlq]
2012-12-17 15:18

  Tris缓冲液;

  甘氨酸;

  各种硫醇 耗费时间长;操作要严格计时;

  颜色深浅随不同蛋白质变化 考马斯亮蓝法(Bradford法) 灵敏度最高

  1~5mg 快速

  5~15分钟 考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时,其lmax由465nm变为595nm 强碱性缓冲液;

  TritonX-100;

  SDS 最好的方法;

  干扰物质少;

  颜色稳定;

  颜色深浅随不同蛋白质变化

  二、双缩脲法(Biuret法)

  (一)实验原理

  双缩脲(NH3CONHCONH3)是两 个分子脲经180℃左右加热,放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能过一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。

  H2O

  O=C C=O

  HN NH

  R-CH CH-R

  O=C Cu C=O

  HN NH

  R-CH CH-R

  H2O

  紫色络合物

  紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有:硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。

  此法的优点是较快速 ,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定。

  (二)试剂与器材

  1. 试剂:

  (1)标准蛋白质溶液:用标准的结晶牛血清清蛋白(BSA)或标准酪蛋白,配制成10mg/ml的标准蛋白溶液,可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要,标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,计算出其纯度,再根据其纯度,称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制,酪蛋白用0.05N NaOH配制。

  (2)双缩脲试剂:称以1.50克硫酸铜(CuSO4•5H2O)和6.0克酒石酸钾钠(KNaC4H4O6•4H2O),用500毫升水溶解,在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液,用水稀释到1升,贮存于塑料瓶中(或内壁涂以石蜡的瓶中)。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现,则需要重新配制。

  2. 器材:

  可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。

  (三)操作方法

  1. 标准曲线的测定:取12支试管分两组,分别加入0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0毫升的标准蛋白质溶液,用水补足到1毫升,然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后,在室温(20~25℃)下放置30分钟,于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值,以蛋白质的含量为横座标,光吸收值为纵座标绘制标准曲线。

  2、样品的测定:取2~3个试管,用上述同样的方法,测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。

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